ウェスタンブロッティングはタンパク質を検出する方法で先日まで毎日のように行っておりました。
***追記(2019/10/1)***
ウェスタンブロッティングに関しては以下記事も書きました。
ウェスタンブロッティングのトラブルシューティング：非特異バンドが多すぎるとき② - こりんの基礎医学研究日記
ウェスタンブロッティングのトラブルシューティング：1次抗体と2次抗体を変えてみる。 - こりんの基礎医学研究日記
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ウェスタンブロッティングの基本原理に関しては、以下のYoutube動画わかりやすいように思いました。
こちらはCSTジャパン株式会社というところが出している動画で、「ウェスタンブロッティングの基礎」というテーマで全6回にわたってプロトコール解説をしています。(上記動画は1回目のものです。)
この中にも出てくるんですが、ウェスタンブロッティングを行った際、2次抗体が非特異的に結合しすぎてしまい目的のバンドが分からない、といったことがしばしば起きてしまいます。
私もこれになかなか苦労しました。
条件を変えて何度行っても非特異バンドが出てしまいます。
これに関しては、私がトライした解決方法を改めてどこかでまとめたいと思っていますが、1つは2次抗体の質です。
感覚的には、企業が販売している試薬は当然品質は一定のように思いますが、各製品も差があるようです。
以下は、すでに紹介したCSTジャパンが提供している「ウェスタンブロッティングの基礎」第5回に出てくるものです。
使用する2次抗体のメーカーや製品によって大きく結果が異なることを示しています。
(2次抗体の違いによって、特異的シグナルの強度が大きく異なると開設されています。)
私も2次抗体以外の条件をすべて同じにして、異なるメーカーの2次抗体を使用して実験を行ってみました。
上記のオレンジと黄色は、2次抗体以外は全く同じ工程で実験していますが、黄色の方は多くの非特異バンドが出てしまっています。
2次抗体のメーカーや各製品の違いは意外に重要みたいです。
さらにラボの先輩に教えいていただいたことなんですが、2次抗体は
F(ab) または F(ab')2
と表示があるものの方がお勧めみたいです。
非特異反応が起きにくいとのことです。
以下のHPに解説が載っています。
今回は以上です。
