インバースPCRを用いたプラスミド変異の入れ方 Site-directed mutagenesis

本日はPCRを利用してプラスミドに任意の変異を入れる方法について紹介していきます。

PCRを用い、プラスミドDNAの一部を書き換えたり、欠損させたり、任意の配列を挿入したりすることができます。

通常のPCRは以下の図のように内向きの2つのプライマーを用い、プライマーに挟まれた部分のDNA断片を作ります。

出典：研究ネット　https://www.wdb.com/kenq/dictionary/pcr

変異を挿入するなどしたいときは、これとは逆に、外向きのプライマーを2つ用い、逆方向にプラスミド1周分のDNAを作るという手法を用います。これをインバースPCRと言います。

以下の図が参考になります。

出典：リケラボ　https://www.rikelab.jp/post/3218.html

上記のように外向きの2つのプライマーを用いてPCRをすると、プラスミドと同じ長さの環状になっていないまっすぐのままのDNA断片が2つできます。この新しくできたDNA断片を次の実験に用いたいのですが、元々のテンプレートプラスミドが邪魔なので、DpnI処理をします。

DpnIは制限酵素の1つであり、認識箇所は以下の通りです。

　GA | TC

　CT  | AG

DpnIが他の制限酵素と異なるのは、メチル化されているDNAのみを切断するという点です。大腸菌などから作られたプラスミドは通常メチル化されていますが、試験管内で作られたPCR産物はメチル化されていません。なので、PCRで作られたものだけが残り、テンプレートとなったもとももとのプラスミドは制限酵素で切られてバラバラになります。

その後セルフライゲーションにて環状にし、新しく変異の入ったプラスミドが出来上がります。入れられる変異の種類はいろいろあります。入れたい変異が組み込まれたプライマーを作る必要があります。

出典：リケラボ　https://www.rikelab.jp/post/3218.html

このとき、プライマー同士は重複してはいけません。

重複部分があるとどうなるかというと、以下のようなプロトコールになります。

出典：Site Directed Mutagenesis by PCR By Guest Blogger https://blog.addgene.org/site-directed-mutagenesis-by-pcr

つまりセルフライゲーションをせずに、次の段階であるトランスフォーメーションに移ります。※セルフライゲーションをしてしまうと重複した箇所ができてしまう。

こちらのサイトも参考になります。

https://lifescience.toyobo.co.jp/user_data/pdf/upload/upload87/kodplus87pc01.pdf

重複部分は大腸菌がうまく調整してくれるようです。もう1つ別のプロトコルを参考までに掲載します。

BACKGROUND

Site-directed mutagenesis involves the use of primer sequences that anneal to a template DNA sequence, targeting a desired area for mutation. Polymerase chain reaction (PCR) methods allow for amplification of genomic targets in sufficient numbers for transformation.

This protocol uses MilliporeSigma's KOD Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase, which allows for high fidelity PCR using a simple three-step thermocycle. It is important to complete the entirety of this protocol in one go, rather than delay performing the PCR, digestion, or transformation. From beginning to end, site-directed mutagenesis using this protocol can be completed in approximately 5 hours, with results from the transformation immediately available the next day.

After PCR, DpnI digestion cleaves any plasmids with methylated sites. This selects for the mutated plasmids (which are unmethylated) by destroying any remaining template DNA that were not mutated in the PCR. The DpnI from NEB is designated as a Time-Saver™ restriction enzyme that can sufficiently digest the PCR product in 15 minutes. However, it is safe to digest for longer periods of time and an incubation period of 1 hour is recommended for this protocol.

In mutagenesis, the final mutated plasmid after PCR and DpnI digestion is generally low in concentration. Therefore, high-efficiency transformation methods must be used with ultra-competent DH5α cells to achieve colonies containing the desired plasmid. The entirety of the PCR product should be used when mixing with the competent cells, and SOC medium is highly recommended for all components of the transformation (outgrowth and plate) over LB medium. Additionally, although high-throughput transformation protocols allow for some steps to be skipped, it is recommended that both heat shock and outgrowth in SOC medium are performed for mutagenesis.

REQUIRED MATERIALS

• KOD Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase, 1.0 U/μL  
• KOD Xtreme™ Buffer, 2X  
• dNTPs, 2 mM  
• Autoclaved Milli-Q® water  
• Forward & reverse primers
• Template DNA, 25 ng/μL
• DpnI restriction enzyme  
• CutSmart® Buffer, 10X  
• DH5α competent cells  
• SOC medium  

PROTOCOL

PCR amplification

1. This step should be performed in a cold room or on ice. For each reaction, combine the following in a PCR tube (adjust Milli-Q® water volume to compensate for template DNA concentration as necessary):

   Component	Volume
   KOD Xtreme™ Buffer, 2X	25 μL
   Autoclaved Milli-Q® water	10 μL
   dNTPs, 2 mM	10 μL
   Template DNA, 25 ng/μL	2 μL
   Forward primer	1 μL
   Reverse primer	1 μL
   * KOD Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase, 1.0 U/μL	1 μL
   Total Volume	50 μL
   * NOTE: Always add the KOD Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase as the last component, immediately before use in thermocycler. Keep the polymerase in the freezer until needed.

2. Spin the PCR tube in a mini centrifuge for 2–3 seconds. Do NOT spin at high rpm—only enough to ensure the polymerase is evenly mixed in.
3. Set the thermocycler for the following cycles:

* NOTE: Adjust time according to the length of the template DNA.

1. Set the lid temperature to 105 °C and the reaction volume to 50 μL.
2. Start the run. The PCR run should take approximately 30 mins per kb of template DNA (e.g. a 6 kb plasmid template will require about 3 hours for PCR).

DpnI digestion

1. Add 5 μL of CutSmart® Buffer directly to the PCR product.
2. Add 1 μL of DpnI restriction enzyme.
3. Spin the PCR tube in a mini centrifuge for 2–3 seconds. Do NOT spin at high rpm—only enough to ensure the enzyme is evenly mixed in.
4. Incubate the PCR tube in a thermocycler at 37 °C for at least 15 minutes.

High-efficiency transformation

1. Thaw competent DH5α cells on ice for approximately 5–10 minutes.
2. Add all of the PCR product to the competent cells tube. Mix by gently tapping the side of the tube. Do NOT vortex or pipette the mix.
3. Incubate on ice for 10–15 minutes.
4. Heat shock the cells in a 42 °C water bath for 40–45 seconds.
5. Immediately place cells on ice for 2 minutes.
6. Add 500 μL of SOC media to the tube.
7. Incubate the cells at 37 °C while shaking at 250 rpm for 1 hour.
8. Spread contents of the entire transformation tube on an SOC media plate containing the appropriate antibiotic. Incubate at 37 °C for 16–18 hours.

TROUBLESHOOTING

If there are issues with mutagenesis, try the following troubleshooting tips:

1. Run a small amount of PCR product (~10 μL) on an agarose gel. If primer dimerization is favored over primer–template annealing, reduce the concentration of primers in the initial PCR reaction.
2. Check primer sequences to ensure they are complementary to the desired target on the template DNA strand.
3. Increase the number of cycles (max. 35) in Step 2 of the PCR.

出典：SEN LAB SITE-DIRECTED MUTAGENESIS

receptor.nsm.uh.edu

ウェスタンブロットのゲル作成

前回の更新からしばらく日が空いてしまいましたが、再び勉強したことや実験でやったことなどを記録していこうかと思います。

本日はウェスタンブロットのゲルを作成しました。ウェスタンは以前にもやったことがあるのですが、その時は市販のゲルを使っていました。始めて自分で作成しましたのでその記録です。

ちなみに以前使用していたゲルはこれ↓

www.bio-rad.com

ウェスタンブロットはタンパク質を検出する手法の1つですが、その過程の1つにSDS-PAGE≒電気泳動があります。この時使用するのがポリアクリルアミドゲルです。

材料は以下の通り

3.5x buffer
40% acrylamide　→分離させたいタンパク質の分子量に伴って必要量が変わる
H2O
BPB (x100) (Bromophenol blue)
10% APS (Ammonium Persulfate, 過硫酸アンモニウム)
TEMED (テトラメチルエチレンジアミン)

ゲルは上下1つのパートに分かれており、上部(サンプルを入れるためのギザギザ部分があるところ)がStacking gel、それより下のサンプルが泳動されていく部分がSeparating gel(running gelなど他の呼ばれ方もあり)と呼ばれている。

それぞれ組成が別なので、それぞれの溶液が必要となる。具体的手順は今の通り。

1．ゲル作成に使用する板やコームをアルコール消毒→水分を除去し乾かす。

2．材料を混ぜる。APS、TEMEDは最後。特にTEMEDは入れるとアクリルアミドの重合が始まるため注意。アクリルアミドの量も注意。作りたいゲル濃度に応じて量が変わる。

3．1．であらっておいたキットを組み立てる。

4．まず下部分=Separating gel用の溶液を、APS、TEMEDを加えたのちに組み立てたキットのすき間に入れていく。ゲルの上端が乾燥しないように、蒸留水やイソプロパノールを5mmくらい重層する。→25分おく。

5．ゲルが固まるので、重層しておいたイソプロなどを取り除き、Stacking gel用溶液を入れる。気泡が入らないように注意しながらコームを重層した液体部分に差し込み、再び25分おく。

6．ゲル完成。4℃にて3日間保存可能。

多発性骨髄腫に関するevidenceあれこれ

いろんな論文の詰め合わせ、備忘録的な意味合いが強いです。

• 日本人移植非適応新規多発性骨髄腫患者に対してD-VMPはBMPよりPFSとOSを延長させる。安全上の大きな問題はなし。(ALCYONE試験)
  【日本血液学会2020】
  
  
  • OS NR vs 43.9ヵ月　PFS NR vs 20.4ヵ月
  • D-VMP群が96％、VMP群が92％だったが、CR以上はD-VMP群が54％、VMP群が23％とD-VMP群が高かった。
  • MRD陰性化率(42%vs8%)も12ヵ月陰性持続率(21%vs8%)とD-VMP群で高かった。
  • 国際他施設試験の結果は2018年NEJM発表。
    Mateos MV, et al. Daratumumab plus Bortezomib, Melphalan, and Prednisone for Untreated Myeloma. N Engl J Med. 2018 Feb 8;378(6):518-528. 
• 移植非適応患者に対するLD vd MPT: Ldの方が有意にPFS, OSともに改善する。
  • PFS 25.7ヵ月 vs 21.2 ヵ月　OS (4y) 59% vs 51%
    Benboubker L, et al. Lenalidomide and dexamethasone in transplant-ineligible patients with myeloma. N Engl J Med. 2014 Sep 4;371(10):906-17. 
• 再発難治性骨髄腫に対するDRｄ vs DPd: Len使用歴に関わらずDRdとDPdは同等。
  

  ashpublications.org

  
  
  • Len暴露あり/不応でない患者:
    ORR DPd 68% vs DRd 82% (有意差なし) PFS/OS中央値有意差なし
  • Len不応患者
    ORR DPd 58% vs DRd 84% (p =0.009) PFS/OS中央値有意差なし
• 再発難治性骨髄腫患者に対するDKd vs Kd: OS, PFSともにDara上乗せ群で有意に延長。 
  • 1～3先行レジメン受けた患者が対象。
  • OS, PFSともにDara上乗せ群で有意に延長。 
  • MRD陰性化率も高い。28% vs 9%
    

    

    Saad Z. Usmani,Hang Quach,Maria-Victoria Mateos,Ola Landgren,Xavier Leleu,David Siegel,Katja Weisel,Xiaomei Shu,Chuang Li,Meletios Dimopoulos, Final analysis of carfilzomib, dexamethasone, and daratumumab vs carfilzomib and dexamethasone in the CANDOR study, Blood Adv, 2023,

    Usmani SZ, et al. Final analysis of carfilzomib, dexamethasone, and daratumumab vs carfilzomib and dexamethasone in the CANDOR study. Blood Adv. 2023 Jul 25;7(14):3739-3748. 
• Real World Data: 再発難治患者に対してどのようなレジメンを選択するか？
  • アメリカの後ろ向き試験。
  • KRd vs DRdのみ死亡リスク、次回治療開始のリスクが高かったが他のレジメン同士の比較では有意差なし。
    Davies F, et al. Real-world comparative effectiveness of triplets containing bortezomib (B), carfilzomib (C), daratumumab (D), or ixazomib (I) in relapsed/refractory multiple myeloma (RRMM) in the US. Ann Hematol. 2021 Sep;100(9):2325-2337. 
    
    
    
• 再発難治性骨髄腫患者に対するIRd vs Rd: IRdで有意に予後改善。
  • PFS 23.1ヵ月 vs 11.6ヵ月(p=0.001) 
  • CR 11.1％ vs 8.8％, VGPR 22.2% vs 13.9％
  • どちらも忍容性高く毒性は同等
    Minarik, J., Pika, T., Radocha, J. et al. Survival benefit of ixazomib, lenalidomide and dexamethasone (IRD) over lenalidomide and dexamethasone (Rd) in relapsed and refractory multiple myeloma patients in routine clinical practice. BMC Cancer 21, 73 (2021). 

MGUSのマネージメント

MGUS(＝monoclonal gammopathy of undetermined significance：MGUS)

意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症

今日の臨床サポートより

• 血中にM蛋白を認めるが少量で、高カルシウム血症、腎機能障害、貧血、骨病変といった形質細胞腫瘍に関連した臓器障害がなく、他にM蛋白を産生する疾患が認められないものを意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（MGUS）と呼ぶ。
• 年に1%の頻度で多発性骨髄腫や原発性マクログロブリン血症、アミロイドーシス、B細胞リンパ腫に進行するリスクがある。

定義に関してはガイドライン参照。

骨髄腫への進展に関しては以下の通り。

• 血清M蛋白量≧1.5g/dL、遊離軽鎖（κ/λ）比が異常の2因子は、MGUSの進行リスク因子である。2因子とも有する、1因子のみ有する、リスク因子なしの3群に分け診断後20年以内に進行するリスクを比較すると、IgM型骨髄腫ではそれぞれ55%、41%、19%、非IgM型MGUSではそれぞれ30%、20%、7%である。
• M蛋白以外の免疫グロブリン（例えばIgG型MGUSの場合は、血清IgAとIgM）が2つとも減少している場合は、正常レベルの患者より進行リスクが2倍高い。
• MGUS患者の平均生存期間（8.1年）は、同年齢・性別の一般人（11.8年）に比べて短いと報告されている。

以下はBloodのHow  I Treatシリーズより。

Go RS, Rajkumar SV.

How I manage monoclonal gammopathy of undetermined significance.

Blood. 2018 Jan 11;131(2):163-173.

• 全患者に骨髄検査を行う必要はなし。低リスク患者のみでOK。
  低リスク患者: IgG型、血清M蛋白1500mg/dL以下、FLC比正常
  ※IgG型かつ血清M蛋白1500mg/dL以下の患者で骨髄形質細胞が10％以上である確率は4.7%、骨病変が見つかる可能性は2.5％と非常に低い。これらの患者が生存期間中に疾患進行する確率は2％ほど。
• フォロー頻度は明確なエビデンスなく、各国ガイドラインごとに異なっており一致率も低い。概ね3～6カ月ごとだが安定していれば2～3年に一度で可とするガイドラインもある。
• フォロー期間の推奨もまちまちだが、米国の研究では最初の1年間がMGUS病勢進行するリスクは最も高く(2.1%)、それ以降は徐々に低下するとされている。低リスク患者ではフォロー終了可。

  

  Ronald S. Go,S. Vincent Rajkumar, How I manage monoclonal gammopathy of undetermined significance, Blood, 2018, Figure 2.

•  M蛋白上昇やFLC上昇が見られる場合も必ずしも病気が進行しているとは限らない。上昇が持続する患者でも疾患進行と関連しエチルは50％ほど。逆にこれらのマーカーの上昇がない場合は疾患は進行していないと判断できる。

• MGUSは遺伝との関連が示唆されているが、かといって家族歴のある患者に全例MGUSスクリーニングするなどは不要。MGUSと告知されることは悪性腫瘍と告知されるのと同等の精神的苦痛があり、追跡コストも莫大なため発見すればよいというわけではない。

多発性骨髄関連腎障害のマネージメント

多発性骨髄腫(MM)の患者はしばしば腎障害を来す。

それに関するレビュー。

Dimopoulos MA, et al.

Management of multiple myeloma-related renal impairment: recommendations from the International Myeloma Working Group.

Lancet Oncol. 2023 Jul;24(7):e293-e311. 

• 診断時に最大50％が腎障害を呈し、2～4％が容積を要する。
• 腎機能障害を有する骨髄腫患者は、ない患者と比較し骨髄腫進行または死亡の相対リスクが高い。
• 腎機能改善は生存期間延長と関連している。
• 腎機能障害は遊離軽鎖が糸球体や尿細管を障害することで起きる。
  ※多発性骨髄腫では単一の軽鎖が多く産生される。通常は重鎖と軽鎖が結合し免疫グロブリンとなるが、大量に作られ重鎖と結合できない軽鎖が腎臓に障害を与える。より具体的には炎症を誘発して線維症を引き起こす可能性がある。
• 腎機能障害患者における各種治療薬の注意点など。
  ①ステロイド
  ②PI
  ③IMids

★腎機能障害で減量等を考慮すべき骨髄腫治療薬

• ステロイド: Total160mgのDEX投与が考慮される。40mg/day*4日間など(高齢者では20mg/day)。診断初月でHD-DEX治療を行うと初発骨髄腫患者にmore rapid renal responseが期待できる。
• PI: ボルテゾミブは腎機能障害時も原料の必要がなく、腎機能障害の有無にかかわらず骨髄腫治療のゴールドスタンダード。カルフィゾミブも腎機能障害の有無にかかわらずクリアランスや奏功は同等。しかしながらカルフィゾミブで腎機能障害が増多する傾向あり使用には注意。
• IMids: 第2世代IMidsであるレナリドミドはeGFR30以上の患者は全量投与可能、それ以下の患者は最大15mg/day推奨。サリドマイドは容量z包摂不要。
• 抗CD38抗体: ダラツズマブ、イサツキシマブ、エロツズマブ全て仁木障害患者での容量調節不要であり腎機能障害患者でも安全に使用可能。

Table 4Dose modifications for anti-myeloma drugs in patients with renal impairment

	Creatinine clearance				On dialysis
	≥60 mL/min	30–59 mL/min	15–29 mL/min	<15 mL/min
Dexamethasone (orally or intravenously)	20–40 mg	No dose modification needed	No dose modification needed	No dose modification needed	No dose modification needed
Melphalan	0·15–0·25 mg/kg per day orally; high dose: 200 mg/m2 intravenously	Reduction by 25% orally; high dose: 140 mg/m2 intravenously	Reduction by 25% orally; high dose: 140 mg/m2 intravenously	Reduction by 50% orally; high dose: 140 mg/m2 intravenously	Reduction by 50% orally; high dose: 140 mg/m2 intravenously
Doxorubicin (intravenously)	According to regimen	No dose modification needed	No dose modification needed	No dose modification needed	No dose modification needed
Cyclophosphamide (orally or intravenously)	According to regimen	No dose modification needed	No dose modification needed	No dose modification needed*	No dose modification needed
Bortezomib (subcutaneously)	1·3 mg/m2	No dose modification needed	No dose modification needed	No dose modification needed	No dose modification needed
Carfilzomib (intravenously)	Loading dose/full dose: 20/27 mg/m2 or 20/56 mg/m2 or 20/70 mg/m2	No dose modification needed	No dose modification needed	No dose modification needed	No dose modification needed, after dialysis
Ixazomib (orally)	4 mg	4 mg	3 mg	3 mg	3 mg
Thalidomide (orally)	50–200 mg	No dose modification needed	No dose modification needed	No dose modification needed	No dose modification needed
Lenalidomide (orally)	25 mg per day	10 mg per day, can be increased to 25 mg per day if no toxicity occurs	15 mg every other day or 10 mg per day, can be increased to 15 mg per day if no toxicity occurs	5 mg per day, can be increased to 15 mg per day if no toxicity occurs	5 mg per day after dialysis, can be increased to 15 mg per day if no toxicity occurs
Pomalidomide (orally)	4 mg per day	No dose modification needed	No dose modification needed	No dose modification needed	No dose modification needed, after dialysis
Daratumumab	16 mg/kg intravenously or 1800 mg subcutaneously	No dose modification needed	No dose modification needed	No dose modification needed	No dose modification needed
Isatuximab (intravenously)	10 mg/kg	No dose modification needed	No dose modification needed	No dose modification needed	No dose modification needed
Elotuzumab (intravenously)	10 mg/kg	No dose modification needed	No dose modification needed	No dose modification needed	No dose modification needed
Belantamab mafodotin (intravenously)	2·5 mg/kg	No dose modification needed	Not determined yet	Not determined yet	Not determined yet
Selinexor (orally)	80 mg	No dose modification needed	No dose modification needed	Not determined yet	Not determined yet
Idecabtagene vicleucel (intravenously)	260–500 × 106 CAR-positive, viable T cells	Not determined yet	Not determined yet	Not determined yet	Not determined yet
Ciltacabtagene autoleucel (intravenously)	0·5–1·0 × 106 CAR-positive, viable T cells	Not determined yet	Not determined yet	Not determined yet	Not determined yet
Teclistamab (subcutaneously)	1·5 mg/kg	No dose modification needed with creatinine clearance >40 mL/min	Not determined yet	Not determined yet	Not determined yet
Venetoclax: off-label for patients with t(11;14)(q13;q32)	800 mg per day orally	No dose modification needed	No dose modification needed	Not determined yet	Not determined yet

• ビスホスホネートはeGFR<30の腎機能障害患者では投与しない。デノスマブはOK。
• 腎機能障害患者に対する自家移植は？
  →AKIではなく安定した腎機能障害患者(stable renal impairment)であれば投与も可能。eGFR<30の患者では200→140mg/㎡への原料を考慮。
• 腎機能障害がある患者とない患者の移植関連死亡率はほぼ同等。最大1/3の患者が移植により腎機能が改善し、1/4の患者が透析不要おとなる。

DLBCLは早期に再発するほうが予後が悪い

Hilton LK, et al.

Relapse timing is associated with distinct evolutionary dynamics in DLBCL.

medRxiv [Preprint]. 2023 Mar 8:2023.03.06.23286584. doi: 10.1101/2023.03.06.23286584. Update in: J Clin Oncol. 2023 Jun 15;:JCO2300570. PMID: 36945587; PMCID: PMC10029038.

• DLBCL初期治療後に再発した患者でセカンドライン治療+自家移植を受けた患者221人を解析。
• 初期再発(9カ月以下での再発)、早期再発(9～24ヵ月での再発)と比較し、晩期再発(2年以後の再発)の方がセカンドライン治療・自家移植の成績が良い。
• 再発までの時間が長ければ長いほど遺伝子変異は増え、初診時とは遺伝子の様相が異なっていた。

CLLに対するアカラブルチニブ

慢性リンパ性白血病(CLL)に対するアカラブルチニブ(商品名:カルケンス)の使用についての文献を3つ取り上げる。

まずアカラブルチニブの概要について。

• BTK阻害薬の1つ。他のBTK阻害薬としてイブルチニブ、チラブルチニブなどがある。
• B細胞受容体シグナル伝達の必須成分であるブルトン型チロシンキナーゼ(BTK)は、CLLにおいて恒常的に活性化しており、CLLの病勢進行に深く関与している。
• In vitroにおいてCLL細胞のシグナル伝達、増殖、接着抑制などに関与していることが報告されている。
• このBTKの阻害が疾患治療に役立つことが報告されている。
• 既にBTK阻害薬の1つであるイブルチニブは初回治療においても再発治療においても、全奏効率(ORR)、無増悪生存期間(PFS)、全生存期間(OS)全て標準治療より延長させるとのことが報告されていた。
  →しかし毒性のため中断がしばしばあった。そこでoff target活性が抑えられたアカラブルチニブが登場。

まず1つ目は2020年。

Woyach JA, et al.

Acalabrutinib plus Obinutuzumab in Treatment-Naïve and Relapsed/Refractory Chronic Lymphocytic Leukemia.

Cancer Discov. 2020 Mar;10(3):394-405.

• 再発/難治性および未治療のCLL患者を対象に、アカラブルチニブとオビヌツズマブの併用の第Ib/II相ACE-CL-003試験。
• 単施設、未治療CLL患者19人(うちSLL1人)、再発難治CLL患者26人。
• 年齢中央値61歳(42-75歳)。3.5年追跡。
• アカラブルチニブ　1000㎎/day day1-28 until PD
  オビヌツズマブ　100 mg on day 1,900 mg on day 2, and then 1,000 mg on days 8 and 15 of cycle 2, and 1,000 mg on day 1 of cycles 3–7
• 全奏効率: 95% (未治療)　92% (再発/難治性)
  完全寛解: 32% (未治療)　8% (再発/難治性)
  無増悪: 94% (未治療)　88% (再発/難治性)　※36か月時点
• 有害事象: Grade 3以上の有害事象が未治療患者の 63%、再発/難治性患者の 77%で見られた。多いものから順に、好中球減少(24%)、失神(11%)、血小板減少(9%)であった。一時中断はあったが、最終的には89％の患者が既定のオビヌツズマブ投与を完遂、やはり89％の患者がアカラブルチニブ内服を継続するなど高い忍容性が確認できた。

この1年後にBloodに以下の論文が発表される。

Byrd JC, et al.

Acalabrutinib in treatment-naive chronic lymphocytic leukemia.

Blood. 2021 Jun 17;137(24):3327-3338.

• Single arm第 1/2 相試験 (ACE-CL-001) 。未治療CLL患者を対象とした研究。
• 99人が登録。年齢中央値64歳、47％がRai分類Ⅲ/Ⅳであった。
• 病勢進行するか不耐となるまで、アカラブルチニブ200mg1日1回、または 100mg1日2回経口投与を継続。追跡期間中央値53ヵ月。
• 14人が有害事象または疾患進行によって治療中断。
• 全奏効率97％(PR90% CR7%)。全てのサブループで同様の結果。
• Grade3以上の有害事象として多かったのは、感染症 (15%)、高血圧 (11%)、出血イベント (3%)、および心房細動 (2%)

そのさらに翌年、以下の論文が発表される。

Munir T, et al.

Cost-effectiveness of acalabrutinib regimens in treatment-naïve chronic lymphocytic leukemia in the United States.

Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res. 2023 Jun;23(5):579-589. 

• 未治療CLLに対する2つの治療をコストパフォーマンス面で比較。
  ①アカラブルチニブ±オビヌツズマブ
  ②クロラムブシル+オビヌツズマブ
  3つの健康状態（progression-free, progressed disease, and death）の質調整生存年当たり推定コストを計算。
• アカラブルチニブ + オビヌツズマブのコストパフォーマンスが高い確率は 34-51%。アカラブルチニブの方がコストパフォーマンス高い可能性が高い(米国の保険システムにおいて) 。