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. 2016; 3: 15059.

Published online 2016 Feb 3.

Treatment of hypophosphatasia by muscle-directed expression of bone-targeted alkaline phosphatase via self-complementary AAV8 vector

①MCKプロモーターによる筋局所的トランスダクション

・MCK(=muscle creatine kinase; 筋肉特異的)をプロモーターとしてEGFPが発現するような配列を作成。これを様々な細胞にトランスダクションすると…

→筋肉細胞(C2C12=C3Hマウスからの筋芽細胞様細胞株)でのみEGFPが発現することを確認。

・scAAV8-MCK-EGFPをマウスに筋注射→14日後観察→EGFP発現が骨格筋・心筋でのみ確認された。

②scAAV8-MCK-TNALP-D 10 –をマウスに注射すると生存期間が延長！

・scAVV8-MCK-TNALP-D 10（2.5×10 12ベクトルゲノム（vg）/ body）を生後1日の新生児マウスの大腿四頭筋(両側)に筋注。

→その後のTNALP-D 10レベルとALP活性を解析。

・1U/ ml以上の血漿ALP→Akp2 - / -マウスの生存延長が可能であることが分かっている。

・生後30日目の未治療Akp2 - / -マウスの血漿ALPは0.05 U / ml（n = 1）。

・scAAV8-MCK-TNALP-D 10 –治療後Akp2 - / -（TNALP-D 10）マウス（n = 9）では…Akp2 + / +（野生型）の10倍以上！

…4.92±1.72U/ml(生後30日)

・未治療マウスと比較して有意に生存期間が延長した。

③治療後Akp2 - / -は正常身体活動レベル

・未治療マウスは生後6-8日で成長障害、生後3週間以内に死亡。

・治療後マウスとWTマウスで総移動距離に有意差なし。(1分あたり何cm進めるか)

④筋注後のALPレベル

・治療後マウスのベクター分布とALP活性を骨格筋、心臓、脾臓、肝臓などの8臓器で検査。

・ベクターコピー数は骨格筋＞心臓＞肝臓の順に多く、ALP`活性は骨格筋＞骨＞生殖器の順に多い。(WT

では、ALP活性は腎臓＞骨＞生殖器の順に多く、骨格筋ではほぼなし。)

・特に注射された筋肉部分で高濃度のALP検出。

⑤TNALP-D 10トランスダクション後マウスでは骨形成が改善

・90日後TNALP-D 10マウス（n = 9）とWTマウス（n = 5）で、前脚、後脚、椎骨などの骨のX線撮影を実施。

・未治療マウスは出生時には正常様、しかし生後20日目に大腿骨の短縮や鼻骨椎間隔の拡大など明らかな変化あり。

・治療後マウス、WTマウスは正常骨格を維持。

・生後90日では治療後マウスで大腿骨が有意に短縮、尾骨椎間隔・椎体間隔が有意に拡大。

→治療により骨形成は改善したものの、長管骨の成長には制限あり？

⑥マイクロCT解析：治療後マウスでの石灰化はやはり不十分

・生後90日治療後マウスを観察→骨幹部では正常骨形成

・しかし骨端骨では皮質骨の欠如や骨端の変形などが見られ、骨形成は不十分であった。

・また低石灰化あり(骨密度、骨体積/組織体積がWTマウスと比較して有意に低い)。

⑦治療後マウス骨の組織・病理学的観察

・治療後マウス大腿骨で、異常な軟骨細胞の増殖と不規則な細胞配置が見られた。

・未治療マウス大腿骨ではALPシグナル見られず、類骨様組織の拡大と異常な軟骨細胞の増殖あり。

・治療後マウスでは、成長板と骨膜外膜にALPシグナルを認めたが、正常よりは低かった。

・治療によってAkp2 - / -マウスでも1U/mlの血漿ALP活性を得ることができ、これにより生存期間延長も可能となったが、大腿骨構造を完全に正常にするには不十分であることが分かった。

次回はDiscussionです。