【実験プロトコール】cDNA合成

今回も実験プロトコールです。

この目的は、自分の頭の整理・知識の確認の他に、いわゆる「おばあちゃんの知恵袋」的な、文献や教科書に載っていないけど知ってるとちょっと役立つようなことを記録しておくことです。

正確性には注意を払っておりますが、利用の際はご注意ください。

今回はRNAからcDNAを作成する方法です。

以下のキットを使用↓

http://catalog.takara-bio.co.jp/PDFS/6210a_j.pdf

1. 以下の溶液を混合(マイクロチューブ使用)
   
   Oligo dT Primer 1μl
   dNTP Mix 　　  1μl
   鋳型RNA            5μl
   H2O                   3μl
   合計　　　　　 10μl
   
   
2. 65℃　5分　→　すぐに氷冷
   
   
3. 以下の反応液を作成　全量を20μlとする
   
   2で作成した混合液　　　　　10μl
   5xPrimeScriptⅡ Buffer　　　  4μl
   RNase Inhibitor (40U/μl)           0.5μl
   PrimeScriptⅡRTase (200U/μl)  1μl
   RNaseFree dH2O                     4.5μl
   合計　　　　　　　　　　　　20μl
   
   
4. 穏やかに撹拌
   
   
5. PCRマシンにて以下のprotocolを用いて反応行う
   30℃　10分　　　【プレインキュベート】
   42℃　30-60分　  【逆転写】
   95℃　5分　　　  【変性】
   
   
6. 氷上で急冷　保存する場合は4℃で！
   
   ※RNAの操作を行うときは手袋等着用。しかし6の段階では既にcDNAになっているので、さほど気にしなくてOK
   
   

キットを使えばさほど難しくないような気がしますね。

今回は以上です。