【実験プロトコール】エチジウムブロマイド(EtBr)によるDNA検出

PCR後検体などをアガロースゲル電気泳動したあとにバンドを見たいとき、エチジウムブロマイドで染色を行い、目的のDNA検出を行います。

今回は、その仕組みを解説しつつ、電気泳動の流れを示したいと思います。

アガロースゲルを作成。
→作成法は以下の記事参照

【実験プロトコール】アガロースゲルの作成 - こりんの基礎医学研究日記
ゲルのウェルにラダーと流したいサンプルを入れる。入れる量は、ウェルの大きさによって異なるが、5-15μlの間程度。ウェルに合わせて微調整。

※ゲルローディングダイはだいたいサンプルの1/5程度の量。たとえば20μl/tubeでPCRを行った場合、PCR後のDNAサンプルも20μlであり、ゲルローディングダイは4-5μlほど入れ、ウェルには10μlほど入れる(=アプライする)。
電気泳動：専用の泳動機にゲルを入れ、TAEで満たし、泳動開始。
「超実践バイオ実験イラストレイテッド」によると、泳動の電圧は、電極板の距離1cmあたり5V程度で流すとのこと。

私は、先輩に教えてもらった100V 25-30minでいつも泳動しています。

泳動時間は、流すDNAの大きさやゲルの濃度などによって変わってくるため、よくわからないときは時々、流れすぎていないか確認する。
染色：タッパーなどにエチジウムブロマイドを溶かした溶液を入れ、その中にゲルを入れ、15-20分ほど待つ。

このとき、DNAを検出する蛍光試薬であるEtBrが、二本鎖DNAの隙間に入り込み、紫外線を照射すると発行する。
※EtBrのみでは、紫外線を当てても発光しない。
※EtBr濃度は、蒸留水またはゲル緩衝液中に0.5～1 µg/mlほど。
観察：トランスイルミネーターなどで紫外線を照射し、バンドを検出。照射時間も実験条件によって異なるが、だいたい1-1.5秒程度。

※ここでバンドが薄いときは…
　1．紫外線照射時間を長くする
　2．EtBr染色を長くする(追加で5-10分程度浸す)
などの対処をする。