本日はシンプルな内容です。LB培地と寒天培地(LBプレート)の作り方です。
1．LBとは？
そもそもLBとはなんだろうと思い調べてみました。
細菌用富養培地の1つで大腸菌などの培養に用いられることが多いとのことでした。組成は以下の通りです。
LB 培地の組成は、以下のように単純である。NaCl 濃度が異なる 3 通りの LB 培地がよく知られている。これにグルコースを加えることもある。水酸化ナトリウム sodium hydrogen を使って pH を調整する。
Miller の LB 培地 Trypton 1%, Yeast extract 0.5%, NaCl 1% Lennox の LB 培地 Trypton 1%, Yeast extract 0.5%, NaCl 0.5% Luria の LB 培地 Trypton 1%, Yeast extract 0.5%, NaCl 0.05% 出典:
上記ホームページに作り方も書いてあります。
液体 Miller LB を 1 L 作る場合
- 950 mL の蒸留水をビーカーにとる。
- Trypton 10 g, Yeast extract 10 g, NaCl 5 g を加えて溶かす。必要な成分が予め混ぜられている製品もたくさんある。
- 1 N NaOH を 1 mL 加える。*1
- メスシリンダー measuring cylinder に入れ、蒸留水で 1 L にする。このとき、ビーカーをすすいで壁面についた培地も回収する。
- メディウム瓶に移してオートクレーブ。オートクレーブの際は、蓋をゆるく締めておくこと。
出典:
私はいつも市販LB粉末を使用しています。
2．LB培地の作り方(1L)
- 1Lが入る耐熱容器を用意する。
- 蒸留水1LとLB粉末25gを入れる。
- オートクレーブ15分間。オートクレーブ時は容器の蓋を緩める。
以上です。シンプルですね。ラボ内では常温保存している先輩もいますが、だいたいの人は4℃で保存しています。
3．LB寒天培地の作り方(100ml, 10㎝プレート5枚分ほど)
- 300ml三角フラスコを用意
- 蒸留水100ml、LB粉末2.5g、Agar粉末1.5gを入れる。
- オートクレーブ15分間。
- ある程度冷めたところで(あるいは冷水で冷やすなどして, 50-60℃程度まで冷めたら)抗生剤を添加。
(当ラボではカルベニシリン1000倍希釈→つまり今回の場合は100ul) - 10㎝プレート5枚に分ける(プレートに注ぎ入れる)。
- ラップなど上からふわりとかけ、ほこりが落ちないようにして冷やして固まるまで待つ。
- 固まったら乾燥しないようにラップなどで包み、プレート面が下になるように4℃で保存。
※アンピシリンの場合は、最終濃度50ug/mlとなるようにするとのこと。
どのプロトコールを見てもだいたい手で触れるくらい冷めた状態(50-60℃)になってから抗生剤を入れる、とありますが、これの根拠は今一つ不明でした。
抗生剤が高温で失活しないようにとのことのようですが、よく使われる抗生剤であるアンピシリンもカナマイシンも100℃ほどの高温でも安定のようです。慣習的なものなのでしょうか。
(酵素を添加する場合は、失活してしまうため高温ではいれてはいけないとのことでした)
あつあつの状態でアンピシリンを添加しても問題なかった、といったネット記事がいくつか見つかりました。
中には、オートクレーブではなく電子レンジで加熱するのみというのも見つかりました。滅菌していないわけですが、コンタミはなかったとのことです。意外と大丈夫なのかもしれません。
LB アガロース プレートの作り方 （投稿者：L.L.） | 試薬調整 | Linked Lab
今回は以上です。
