実験プロトコールについて書いていきます。
この目的は、自分の頭の整理・知識の確認の他に、いわゆる「おばあちゃんの知恵袋」的な、文献や教科書に載っていないけど知ってるとちょっと役立つようなことを記録しておくことです。
正確性には注意を払っておりますが、利用の際はご注意ください。
まずは、実験室に来て最初に習った、細胞の継代の仕方です。
細胞の継代の仕方
主に接着細胞の継代の仕方です。293TやHeLaなどがこれに当たります。
※10㎝ dichの場合です。使用するトリプシンや撒く細胞量などは、プレートの大きさによって異なります。
1．培地を37℃ウォーターバスなどであたためる。(冷たい培地に細胞をさらすとストレスがかかるため予めあたためておく)
2．37℃インキュベーターからプレートを取り出し、クリーンベンチ内へ。プレート傾け、端にたまった古い培地を吸引する。アスピレーターは1点で固定し動かさない。
3．PBS(-) wash: PBS(-)10mlほどを入れて吸引。このとき、接着細胞がはがれてしまわないように、ピペットマンの先をプレートの内側側面につけてゆっくりとPBSを入れる。その後の実験によっては2-3回繰り返す。
4．プレートに接着している細胞を剥がすため、0.05w/v%トリプシン/EDTA 2mlをプレートに入れ、5-10分間37℃インキュベーターへ入れ、インキュベートする。
5．新しい培地10ml程をプレートに入れ、十分に懸濁。
6．Cell count(遠心後に行うことも)
7．遠心 1200rpm 3分
8．上清を吸引し、ペレットをタッピングで崩した後に新しい培地を入れ(cell count結果を参考に、目的の濃度になるように培地を入れる)、懸濁。
9．最適な細胞密度になるように、新しいプレートに撒き、37℃インキュベータ―へ。
あまりよくないとは思いますが、遠心の際の懸濁は培地ではなくPBS(-)でも、その後の細胞の広がりにはさほど影響ないような印象です。
継代時期
コンフルエント(=プレートが細胞でいっぱいになってしまっている状態)になる前に継代が必要とされています。細胞でいっぱいいっぱいの状態になった後に継代すると、その後も広がるものの、例えばウイルス作成の際にウイルスタイターが低くなってしまう原因になるようです。
まだまだ余裕あり↓
細胞でいっぱい↓
1枚目と2枚目の中間ぐらいで継代するのがよいようです。
出典:培養細胞の継代に関する知っておくべき基礎知識 https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/guidelines-for-maintaining-cultured-cells/
上記のポイントで継代するのが最適なようです。
今回は以上です。
