専門医試験のレポート提出があったため、前回の投稿から少し日数が空いてしまいました。
また、少しずつ投稿していきたいと思います。
本日はマウスへの骨髄移植実験についてです。
なぜ骨髄移植実験が必要か？
造血幹細胞は、多分化能と自己複製能を有しており、造血幹細胞に何らかの操作を加えたとして、それが失われないかを調査する方法の1つが移植です。
例えば、造血幹細胞はたくさん培養することが難しいとされてきました。そこで、造血幹細胞をたくさん何倍にも増やすことができる培養液Aを開発したとします。これで培養した造血幹細胞が、普通の(originalの)造血幹細胞と同じく、多分化能と自己複製能を有しているかを調べるの方法の1つが造血幹細胞移植です。
致死量放射線を照射したマウスに培養液Aで培養した造血幹細胞を移植します。
マウスが…生存→造血されている！多分化能と自己複製能が維持されていると考えられる。
マウスが…死亡→造血されていない！多分化能と自己複製能が失われていると考えられる。
しかし注意しなければならないのは、マウスが死亡してしまった場合、単純に手技に問題があって移植そのものが失敗している場合もあります。(例えばマウスへの注射がうまくいっておらず造血幹細胞がマウスに注入されなかった…など。)
このあたりを区別するためにあるのがcompetitive Transplants=競合的造血再構築能アッセイです。
解析したい細胞(上記の例で言えば、培養液Aで培養した造血幹細胞)とともに競合細胞(異なる抗体の発現しているcontrolとなる造血幹細胞)を一緒に移植します。
この方法について、"Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness"を参考に書いていきます。
Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness
Edward O. Kwarteng and Krista M. Heinonen
J Vis Exp. 2016; (114): 54345.
【Introduction】
・放射線や化学療法、アポトーシスなどで減ってしまった血球は主に造血幹細胞で補われ、この機能は血液疾患の治療にも利用されている。
・近年では、SLAMファミリーメンバーの一部であるCD150やCD48などいくつかの細胞表面マーカーを用いるとHSCを50％の綬度まで濃縮できる。
・造血幹細胞の機能を評価する他の目のゴールドスタンダードは、放射線照射後宿主での血球再増殖能評価(in vivo repopulating assay)である。
・競合と非競合がある。
①非競合…controlのHSCとtestのHSCは別々のマウスに移植され、結果も独立。
②競合…controlのHSCとtestのHSCはは1つのマウスに移植される。
→今回は競合アッセイについて解説するが、非競合アッセイにも応用できる。
上図A：論文より引用。上の例に照らし合わせて解説すると…
CD45.2マウスからとり出したHSCを培養液Aで培養してたくさん増やす。それをCD45.1マウスから取り出した骨髄細胞とともに別のマウス(放射線照射後)に移植。
→4～16週間後…フローサイトメトリーで解析すればCD45.1由来の細胞とCD45.2由来の細胞の比率が分かる！！
※Bに関しては今回の記事では触れていません。
【Protocol】※一部関簡略化
- レシピエントマウスの準備
1-1．CD45.1 + CD45.2 +レシピエントマウスを使用。ナンバリングと体重測定を実施。7-12週齢を使用。
1-2．450rad x2回の放射線照射を実施。
→これによってレシピエントマウスの造血を破壊。
※１Gy=100radであるため、450rad=4.5Gy - ドナーと競合骨髄細胞の調整
2-1．ドナーマウスと競合細胞用マウスを安楽死。
2-2．大腿骨と脛骨を取り出し筋肉を剥ぐ。
2-3. PBSを用い骨髄細胞を回収し、懸濁→細胞数カウント。
(Crush法かFlash法) - ドナー細胞HSC確率
3-1．フローサイトメトリー染色用チューブに上記で取り出した細胞の内、3 x 10 6個の細胞（30 µl）を入れる。CD16 / CD32抗体を添加（PBSで希釈し最終濃度2.5 µg / ml）→室温5分。
※非特異的染色をブロックする。
3-2．90 µlの蛍光標識抗体マスターミックス（ビオチン化Lineageカクテル…B220、CD3e、CD11b、GR1、Ter119）、Sca1、CD117、CD135、CD150）を添加。遮光、氷上30分。
3-3．2ml染色バッファーを加えボルテックス→4℃5分200gで遠心（未結合抗体を除去）
→上清をデカントで除去、フリックにて再懸濁。
3-4．染色バッファーで希釈した10 µlの蛍光色素結合ストレプトアビジンを添加（文献中のMaterialを参照）→氷上20分
→前ステップと同様に未染色状態除去
3-5．Lin - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 +細胞（推定HSC）の濃度・頻度をフローサイトメトリーで解析。
3-6．以下の式に基づいて、移植に必要な細胞数を計算。
#transplanted HSCs / recipient = 5 x 105 cells x estimated HSC frequency (as determined for baseline sample; this number is usually between 75 and 125 for wildtype C57Bl/6 mice).
3-7．最終量（マウスに注射する量）が5x10^5個cell/200μlとなるように調整。 - 移植
マウス外側尾静脈より細胞懸濁液を静脈注射。注射部分を圧迫止血。
オプション：感染を防ぐため飲用水に抗菌薬を添加。2-3日毎にマウス体重を測定し、15-20％の体重減少が見られたマウスは安楽死させる。 - 末梢血解析
～省略～
これはまた別で記事を書ければと思っています。。。 - 結果の解釈
上図のA,B,Cを見てみる。
※ここではCD45.1がcontrol、CD45.2がtest細胞とする。
A：CD45.1集団の割合≒CD45.2集団の割合
→controlとtest細胞はほぼ同等の骨髄再増殖能
(最初の例で言うと、培養液Aで培養した骨髄細胞は十分な骨髄再増殖能を持っている。)
B：CD45.1集団の割合＞CD45.2集団の割合
→test細胞はcontrol細胞ほどの骨髄再増殖能はない。
(最初の例で言うと、培養液Aで培養した骨髄細胞は、再増殖能が失われてしまっている。)
C：CD45.1集団の割合もCD45.2集団の割合もどちらも少ない。
→移植がうまくいっていない＝マウスへの注射が失敗している。つまり骨髄増殖能を有効に判断できない。※移植が完全に失敗し、放射線照射もきちんとなされていれば、造血する細胞はほぼなく、マウスは死んでしまうはずなので、放射線照射が十分でなかった可能性もあり。
今回は以上です。
